Language
抽出

ブログ

ホームページホームページ / ブログ / 抽出
search

Jul 03, 2023

2023 年のコーヒーと紅茶に最適なマグカップ 15 選

Dec 03, 2023

知っておくべき5つのアンプヘッド

Aug 20, 2023

2023 年のベスト花崗岩クリーナー 8

Jan 02, 2024

SARS に対する唾液の精度

Jul 02, 2023

準備完了: 秋と休日の集まりのテーブル風景

お問い合わせを送信してください
送信

Jan 09, 2024

抽出

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4241 (2023) この記事を引用 424 アクセス 2 Altmetric Metrics の詳細 新型コロナウイルス感染症パンデミックの一環として、臨床検査室は次のような課題に直面しています。

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4241 (2023) この記事を引用

424 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

新型コロナウイルス感染症のパンデミックの一環として、臨床検査室は検査量の大幅な増加に直面しており、その結果、サンプル収集システム、試薬、スタッフの不足が生じています。 当社では、コストと技術者の時間を最小限に抑えるために、自己収集した生理食塩水うがいサンプルを利用してハイスループットの SARS-CoV-2 マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 検査を最適化しました。 これは、核酸抽出を省略し、広く普及しているロボットリキッドハンドラーである Hamilton STARlet でのサンプル処理を自動化することによって実現されました。 ハミルトン STARlet ソフトウェア システムによってサンプル ID を読み取るためのカスタマイズされたバーコード スキャン スクリプトは、一次チューブ サンプリングを可能にするために開発されました。 事前に凍結された SARS-CoV-2 アッセイ反応混合物の使用により、アッセイのセットアップ時間が短縮されました。 検証とライブテストの両方において、アッセイでは偽陽性または偽陰性の結果は生成されませんでした。 検証中に検査された 1,060 サンプルのうち、3.6% (39/1060) のサンプルは、単一遺伝子陽性、内部制御不全、または液体吸引エラーのいずれかであったため、再検査が必要でした。 全体的な所要時間は自動化ワークフローの方がわずかに速いだけでしたが (185 分対 200 分)、実践時間は 76% 削減され、スタッフの疲労と燃え尽き症候群が軽減される可能性がありました。 サンプルの自己収集から自動化された直接 PCR 検査までのこの説明されたプロセスにより、人的資源と試薬要件の点で医療システムにかかる全体的な負担が大幅に軽減されます。

鼻咽頭ぬぐい液検体 (NPS) の採取は、依然として SARS-CoV-21,2 の診断検出のゴールドスタンダードと考えられています。 このサンプル収集モードには、患者に不快感を与えることや、サンプル収集プロセスを正確に収集または監督するために専任の医療従事者 (HCW) が必要となるため、リソースが大量に消費されるなどの欠点があります。 NPS サンプリングのパフォーマンスが低いと、サンプル収集が不十分または不適切であるため、偽陰性の結果が生じる可能性があります。 これに対処するために、できれば自己採取による、管理が簡単な代替サンプルタイプが、新型コロナウイルス感染症のパンデミック中に積極的に模索されました。 唾液は、最初に検証された非侵襲性の非 NPS サンプルタイプであり、ゴールドスタンダードの NPS 検体タイプと同様の性能を持つことが判明しました 3、4、5、6。 SARS-CoV-2 ウイルスはこのマトリックス中で 72 時間以上安定である7ため、特殊な採取装置や防腐剤を必要としないという経験的観察により、自宅で自己投与によるサンプル採取を実行できる可能性が開かれました。 大規模な RNA 精製処理を行わずに唾液を RT-qPCR アッセイ反応混合物に直接添加する「抽出フリー」PCR プロトコール 8,9 の開発により、このタイプのサンプルの臨床的許容性がさらに高まりました 5。 これにより、連邦医薬品局（FDA）は、緊急使用許可（EUA）規制に基づいて、SARS-CoV-2検出のための唾液サンプルと、Saliva Direct10と呼ばれる唾液検査用の直接PCRプロトコルを承認した。

NPS サンプリングの簡素化された代替手段としての唾液の利点にもかかわらず、ハイスループットの SARS-CoV-2 検出のための唾液の実際の実装は、診断検査機関にとって困難であることが証明されています 11。 粗唾液は粘性があり、採取後すぐに凝固する可能性があります6。 このため、手動または自動リキッド ハンドラーでのピペット操作が困難になります。 粘度を下げるには、特定のバッファーでの希釈 4、12、13 またはプロテイナーゼ K5 とのインキュベーション、その後の熱処理 (95 °C で 30 分間) による除タンパク質剤を不活化するなど、個別の手順が必要です。 これらの分析前ステップは実装が簡単ではありますが、手動で実行する必要があるため、臨床検査室にさらなる作業負荷が課せられます。 これを軽減するために、ユニバーサル/ウイルス輸送媒体 (UTM/VTM) のような液体媒体で唾液を収集することが提案されています 14。 しかし、これらの液化/安定化剤の阻害的性質により、元のSaliva Directプロトコルの実施が困難になり、診断研究所は標準的なRNA精製方法を使用して唾液サンプルを処理する必要があります15、16、17。 この検査経路は時間がかかるだけでなく、特にリソースに課題のある環境において、SARS-CoV-2検査を手頃な価格で提供しようとするSaliva Directプロトコルの本来の目的に反している。

 4 years old) while preserving their performance when compared with HCW collected NPS20,21 This freed up clinical resources and saved NPS collection devices, which were in critically short supply at the time22. Further studies showed saline gargle was also amenable to extraction-free PCR, but unlike saliva, did not require complex pre-analytical processing due to its water-like consistency23,24. The simplicity of this process opened up the possibility of automating the testing process on a liquid handler. The goal of the present study was therefore to describe the optimization and implementation of the Spike/ORF8/RNaseP (SORP) multiplex PCR test to the gargle Direct-PCR (GDirect-PCR) format on an automated liquid handling platform—the Microlab STARlet (Hamilton Robotics, NV, USA) liquid handling system, henceforth referred to as Hamilton GDirect-PCR (HGDirect-PCR)./p> 65 °C (Fig. 1). This suggested that the PCR annealing temperature of 60 °C, set in the original SORP version 1 assay for purified RNA templates, was not optimal for saline gargle templates used in direct-PCR conditions. When RNA was extracted from saline gargle samples and used as a purified template, both the S/ORF8 targets amplified optimally at 60 °C (Fig. 4_suppl) and any departure from this temperature (> 60 °C), resulted in a gradual decrease in the detection signal of both these targets. This suggested that the performance of the spike gene target was influenced by both the temperature and nature of input template (purified RNA vs unpurified saline gargle). The ORF8 amplification was not affected by the type of input template but an, increase in temperature from the optimal 60 °C did result in dampening of the amplification signal (Fig. 4_Suppl)./p> 98% analytical sensitivity26. We also noticed poor performance of our original S/ORF8 assay where random dropout of the S gene target was observed on the GDirect-PCR workflow. However, this was addressed when the assay was re-optimized (SORP version 2). We would like to also add that, due to frequent mutations observed in the S-gene (https://covariants.org/), there could be possibilities of observing S-gene dropouts (S-/ORF8+). Getting this result would invariably lead to excessive burden of additional confirmatory testing as per our testing algorithm (Fig. 3). Under such circumstances, the most prudent remedial measure would be to perform a detailed in-silico analysis of the S-gene’s primer/probe set and implement any potential modification(s) to its sequence./p>