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May 17, 2024

逆転写

Scientific Reports volume 13、記事番号: 11470 (2023) この記事を引用 9845 アクセス 4 Altmetric Metrics の詳細 この論文で説明されている手順は、トランスクリプトームの新しい方法を表しています。

Scientific Reports volume 13、記事番号: 11470 (2023) この記事を引用

9845 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この論文で説明されている手順は、潜在的な DNA コンタミネーションの除去の必要性を回避する、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) によるトランスクリプトーム解析の新しい方法を表しています。 既存の方法論と比較して、私たちの方法は、RNAの完全性を維持し、DNAの除去に使用される材料や試薬を必要とせず、設定する必要があるサンプルの数も減らすため、より正確で、より簡単で、より再現性が高くなります。をネガティブコントロールとして使用します。 この新しい手順では、逆転写ステップ中に、ミスマッチ塩基を含む特別に修飾されたプライマーを使用することにより、ゲノム DNA とは異なる cDNA 分子を生成します。 ゲノム DNA テンプレートは部分的にプライマーに対して異種であるため、PCR 増幅で同じ修飾プライマーを使用すると、cDNA テンプレートのみが増幅されます。 このように、PCR による増幅は cDNA テンプレートのみに特異的であるため、潜在的な DNA コンタミネーションの影響を受けません。 さらに、現在の DNA 除去方法で一般的に使用されているさまざまな物理的または酵素的処理により変化する傾向があるサンプルの初期 RNA 濃度を正確に反映します。 この方法は、サテライト DNA などの反復性の高い DNA 転写物の定量に特に適しています。

PCR 増幅による転写物の定性的および/または定量的分析は、分子生物学研究と医療診断の両方で選択される方法です1。 メッセンジャー RNA、リボソーム RNA、ノンコーディング RNA など、さまざまなタイプの転写産物を検出および定量するために広く使用されています。最も一般的な用途には、遺伝子発現分析や特定の微生物の正確な同定が含まれます。

適切に分析するために、精製された RNA は、逆転写酵素によって RNA 分子が cDNA (相補的 DNA) に変換される、逆転写の予備的かつ基本的なステップを受けます。 実際、RNA 自体は後続の PCR ステップ中に直接増幅することができないため、必然的に cDNA1 に変換する必要があります。 現在使用されているほとんどのプロトコールの主な問題は、しばしば存在する DNA 汚染にあり、PCR 増幅中にポリメラーゼ酵素によって cDNA と構造レベルで化学的に区別することが不可能であるため、偽陽性結果が生じます 2、3、4、5。 6、7。 この制限を克服するために、現在のすべてのプロトコールには、RNA の精製中とその後の逆転写ステップの両方で、いくつかの DNA 除去ステップが含まれています。 どちらの場合も、特定の機械フィルター (シリカベースのカラム) を使用するか、DNase I (デオキシリボヌクレアーゼ I) などの特定の酵素による酵素消化を通じて DNA が除去されます8。 ただし、これらの処理は DNA の除去に 100% 効果的ではなく、多くの場合 DNA 汚染として残ります 2,3。 これは特に、真核生物のゲノムの実質的な部分を構成し、低レベルで転写されることが多い反復性の高い DNA の場合に当てはまります。 さらに、サンプル中の DNA の濃度を下げるために実行される手順はいずれも、本質的に不安定で分解しやすい分子である RNA 自体の初期濃度も確実に低下させることを強調する必要があります。

今回我々は、PCR によるトランスクリプトーム解析の新しい方法を報告します。この方法では、cDNA と DNA が区別されるため、後者による汚染が排除され、より正確で信頼性が高く、再現性のある結果が得られます。

新しいプロトコールをテストするために使用したフォワード、リバース、および修飾プライマーを表 1 に示します。修飾特異的プライマーは、未修飾のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと比較して、変更されていないヌクレオチドと交互に分布するわずか 4 つの塩基変化 (点突然変異) が異なります。プライマーの 3' 末端 (表 1 では太字でマークされています)。